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荧光素标记抗体技术

普罗安蒂诊断抗体,蛋白表达 2018-08-24

荧光素标记抗体技术

一) 原理

  目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合,标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光,通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

  (二) 操作步骤

    将纯化的IgG抗体对PH9~9.5碳酸盐缓冲液透析过夜,
    透析后抗体液移入小烧杯中

              ↓

    称取适量IFTC,加入二甲亚砜(DMSO)(FITC~1mg/1ml DMSO)
    使终浓度为1mgFITC/1mlDMSO
    FITC/IgG比例:如IgG浓度为1mg/ml,FITC/IgG比例约为50μgFITC/mgIgG;
    如IgG为5~10mg/ml,则比例为25μgFITC/ml IgG
    在10ml小烧杯中先放入抗体

              ↓

    按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中

           ↓

    将标记物用PBS加至2.5ml,磁力搅拌器室温下避光搅拌2h

           ↓

    用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素,先用25ml PBS淋洗G25柱

           ↓

    收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰,测定F/P
    比值。第二个荧光素峰为游离荧光素

    计算:

         2.87×A495
    F/P=────────
        A280-0.35×A495

    合适的F/P值为2~4。

  (三) 试剂器材

  1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。

  2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。

  3. PBS、DMSO

  4. PH9~9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g,NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。

  5. PD10柱(Sephadex G25柱)

  6. 磁力搅拌器,紫外分光光度计等

  (四) 注意事项

  1. FITC保存于4℃暗处,使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取,以避免潮解。

  2. FITC-DMSO液要临用时配制。

  3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。