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双抗体夹心法实验原理

普罗安蒂诊断抗体,蛋白表达 2018-08-20

双抗体夹心法(常用于测定抗原)实验原理:

  用特异性抗体包被于固相载体,经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合,经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定,底物降解的量即为欲测抗原的量。

  

  双抗体夹心法实验步骤:

  一、材料准备:

  1. 实验材料:血清、血浆、体液

  2. 实验仪器:酶标比色计、96 孔板、移液枪、离心管、离心管盒

  3. 所需试剂及试剂盒:碳酸盐包被缓冲液、抗体球蛋白、吐温-20、柠檬酸、硫酸

  二、实验操作方法:

  1. 包被抗体:用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1~10 μg /ml),每凹孔加 0.3 ml,4℃ 过夜,或 37℃ 水浴 3 小时,贮存冰箱。

  2. 洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含 0.05% 吐温-20)洗 3 次,每次 5 分钟。

  3. 每凹孔加入 0.2 ml 用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本,37℃ 作用 1~2 小时。

  4. 洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含 0.05% 吐温-20)洗 3 次,每次 5 分钟。

  5. 加入 0.2 ml 用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液,37℃ 作用 1~2 小时或由预试实验确定作用时间。

  6. 洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含 0.05% 吐温-20)洗 3 次,每次 5 分钟。

  7. 加入 0.2 ml 底物溶液于每个凹孔(OPD 或 OT),室温作用 30 分钟(另作一空白对照,0.4 ml 底物加 0.1 ml 终止剂)。

  8. 加终止剂:每凹孔加 2M H2SO4 或 2 M 柠檬酸 0.05 ml。

  9. 观察记录结果:目测或用酶标比色计测定(OPD 用 492 nm)OD 值。