QQ:1932526095
蛋白表达,抗体定制
咨询电话
029-88081325
在线客服

抗原结合抗体的鉴定技巧

普罗安蒂诊断抗体,蛋白表达 2018-08-17

当用纯化抗原进行选择时,评价所选择抗体的最佳方法是在高通量滴定模式下进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。虽然这也许与抗体最终使用无关,但它提供了一个起始的筛选实验方案,能够让续后的分析集中在有希望的抗体上。大多数噬菌粒展示载体的设计容许进行两种ELISA模式:

  一种是噬菌体ELISA,即用标记的抗噬菌体二抗试剂检测已结合的噬菌体;

  另一种是可溶性scFv ELISA,即借助附在N端或C端上的表位标签来检测可溶性scFv。在这两种情况下,抗体表达都由lacZ启动子驱动。噬菌体展示取决于缺失葡萄糖时的渗漏表达,同时为了诱导可溶性抗体片段的表达,也需要使用IPTG。曾用来进行检测的标签包括:9E10、SV5以及FLAG。

  总体上,尽管我们也发现一些抗体在噬菌体模式可以有信号,而在可溶性模式下却消失,但两种ELISA模式的结果是类似的。这也许是抗体发生了框移所致。当这些抗体展示在噬菌体表面时,会有大量的scFv被检测到;而当表达为可溶性scFv时则不行。这种情况正如前面在肽文库所描述的那样。大多数目前所使用的噬菌粒载体都容许从噬菌体结合性scFv简单切换到可溶性scFv。这要通过包括1个位于scFv基因和gⅢ之间的可抑制性琥珀密码子(TAG)来实现。在一个非抑制株(如HB2151)中,琥珀密码子被读作为终止子,因此,只有可溶性scFv生成。在一个非抑制株(如TGi、DHSaF’)中,TAG密码子读作谷氨酰胺以及终止密码子,因此,可溶性scFv和scFv—pⅢ融合蛋白都将生成。也许理想的情况是,通过感染抑制株进行由噬菌体结合性scFv到可溶性scFv的转换,但实际上这并不必要。可溶性scFv的表达在抑制株内是很容易完成的,因此,抑制通常不过50%。粗制噬菌体或scFv样品就可适合于大多数的预分析试验。然而,如能简单地进行抗体纯化对于后续分析是有利的。最好是用包含六组氨酸标签的噬菌体载体,或者是将scFv基因亚克隆到一个将六组氨酸标签融合到scFvC末端的载体中。

  不同轮次选择中,阳性克隆的比例将取决于抗体文库质量、抗原性质和物理选择过程,包括抗原密度、是否用可溶性或固相抗原以及洗涤严谨性。我们发现:按照免疫管选择程序,在第二轮后一般有10%~100%的克隆是阳性的。最好尽早评估多样性,因为随着选择的进行,多样性会降低。这样就能提供一个更大容量的抗体文库,便于从中选择合适的抗体。

  尽管结合性筛选方法是有用的,但这些常不将此法用于最终的抗体选择。能够相对快速地生成大量抗体,可以容许建立一些除结合性方法之外的筛选方法。用于细胞内化、受体活化、配体拮抗、病毒灭活、诱导或抑制凋亡的各种选择方法,均可预期。而且,在某些情况下,例如内化,甚或可能直接选择具备这些功能的抗体。

  采用ELISA时,噬菌体抗体可以在96孔微量滴定板中制备。将单个克隆挑人板孔中、培养并作为噬菌粒用辅助噬菌体进行救援。在微量板模式下噬菌体的生产效率不及更大体积的培养。这是因为不同克隆的生长率差异过大,结果有些克隆感染辅助噬菌体是在最佳OD值时,而其他克隆却是在OD值过高或过低时感染。这就导致了不同孔中噬菌体滴度差异很大。