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抗体纯化常见问题

普罗安蒂诊断抗体,蛋白表达 2018-08-13

1,对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品,有哪些样品处理的方法?

在纯化前,合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高 纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱,延长使用寿 命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂 蛋白,酚红,小分子污染物等等。
腹水中经常含有高浓度的脂蛋白,这些脂蛋白和脂 类物质会堵塞层析柱,最好能在纯化之前去除。方法一是 在二价离子存在的情况下,硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋 白,沉淀可以通过离心除去;方法二PVP能产生一个pH值 依赖的沉淀效应,PVP在pH=7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球 蛋白。很多时候,可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释 腹水,不仅保证样品的结合pH,还有利于降低黏度。
酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然 并不直接的影响纯化,但是酚红可能结合到某些纯化介质 上,应该尽可能早的被除去,可以使用脱盐柱除去酚红。 对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除,如
硫酸铵沉淀,羊脂酸沉淀的方法。
最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐,把样品换到 合适的缓冲液中(PH和盐浓度),并除去没有用处的小分 子。更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。

2,实验室需要纯化小鼠的IgG1,我是选择ProteinG还是ProteinA?

首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强 度”表(图1)来获取选择哪种配基的指导,针对小鼠的 IgG1, ProteinA结合相对弱,可以选择ProteinG配基的介 质。但由于Protein G结合力较强,因此有时需要pH低于2.0 才能有效洗脱,容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。 此时可以考虑结合力相对较弱的protein A填料,结合缓冲 液中需要加入0.5~3M 的氯化钠以增加结合能力,目标抗体 在pH4.5左右就可以被温和的洗脱。
若实验室有AKTA系统,那么Hitrap ProteinG HP是高分 辨率方便快捷的首选。
若没有AKTA系统,MabTrap抗体纯化试剂盒可以给你 带来最大的快捷和便利,试剂盒含有一个Hitrap ProteinG HP1ml的预装柱,结合,洗脱和中和的缓冲液,一个具有 接头的注射器、以及经过优化的纯化操作规程。
Ab Spin Trap是预装了100ulProteinGHP填料的离心 柱,和标准的小离心机一起使用,仅用20分钟就可以完成 一次小规模的抗体纯化。
ProteinG HP MultiTrap96孔板适用于高通量的筛选。

3,面对ProteinA如此多的配基形式,它们有何区别 和应用?

蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株 系,它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结 构域,可以特异性的和样品中的抗体分子结合,而使其他 杂蛋白流穿,具有极高的选择性,通常一步亲和层析就可 达到超过95%的纯度。
ProteinA sepharoseCL-4B,是将从金黄色葡萄球菌表 达纯化出蛋白A通过CNBr的方法偶联在sepharose CL-4B的 介质上,可以纯化体液或细胞培养液中的免疫球蛋白。
nproteinA sepharose4FF,nprteinA即为天然 (Native Protein
A),表示其在生产过程中没有引入任何动物来源的组分。
rproteinA sepharose4FF,重组的蛋白A (rProtein A), 经基因工程改造后含有一个C末端半胱氨酸,可以单一位 点定向偶联于琼脂糖骨架上,有效降低空间位阻,增加了 与IgG 的结合能力。同时配基在发酵和纯化过程中没有引 用人源的IgG,避免了人源IgG的污染风险。
rmpProteinA,多位点附着的技术,保证更低的配体 的脱落。一步高度纯化单抗和多抗。

Fast Flow填料,高流速琼脂糖具有高流速高载量,更低的 配体脱落,易于清洗与除菌消毒,寿命更长、更经济,适 合快速高效的进行抗体生产和放大,已经成为治疗用单抗 纯化和放大的标准介质。

4,为什么洗脱之后没有看到正确的条带?

首先我们先看样品是否结合了?先查不同的种属亚型 ,看有没有亲和性,柱 子选得对不对。然后检查结合缓冲液和样品的pH是否7.3 附近。必要时将原始样品和流穿跑还原和非还原SDS-PAGE 进行分析,有条件可以做Western Blot,或检测Elisa是结合 上去没有洗脱?
检查洗脱缓冲液pH对否?建议依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脱,跑电泳或ELisa等检测洗脱产物洗脱峰是否立即中和?蛋白长期在酸性条件下易水 解,中和后也容易产生沉淀跑电泳的loading buffer是否新鲜配置?(常遇到还原loading buffer中DTT失效,导致电泳条带位置不对)

5, ProteinA和ProteinG填料如何清洗再生?

对于Sepharose基架的ProteinA和ProteinG填料的清洗 方法可以参考(预装柱同样适用此清洗方法):
对于沉淀或变性的蛋白:
用6 M 盐酸胍清洗2 个柱体积,立即用5 个柱体积的 PH7-8结合缓冲液来清洗,反向冲洗,每次清洗时间不超 过10min。
对于去除疏水性的物质:
70%乙醇浸泡12小时左右,然后立即用5个柱体积的
PH7-8结合缓冲液来清洗,反向冲洗。
对于新一代的Mabselect SuRe的介质,通过改造对碱 敏感的Asp 氨基酸突变为耐碱的氨基酸得到新的四聚体配 基SuRe配基,将此新配基偶联到高流速琼脂糖基质上, 成为耐碱的新型高流速Mabselect SuRe 蛋白A 层析介质, 可以耐受0.1~0.5N的氢氧化钠在位清洗/消毒大大降低了抗 体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险,清洗效果更 好,有利于延长介质使用寿命,同时也大大降低了CIP/SIP 的成本。

6,抗体药物纯化过程中,如何降低聚集体含量?

在上游细胞培养,控制最佳的收获时机(TOH),避免 培养过程中抗体聚集;相比其他蛋白A填料,Mab select SuRe可以用更温和 的洗脱条件,即提高洗脱pH 0.5-1个单位;亲和低pH洗脱液中加入保护剂 (Arg等); 亲和低pH洗脱后,快速中和; 适当降低亲和层析进样量; 样品处理和纯化过程中,尽量保持较低的温度 (4-8C) 使用Superdex200, 离子交换层析, 疏水层析, Captoadhere等层析技术去除聚集体。

7,含FCS培养表达的human IgG的纯化中,如何避免 牛IgG干扰?

选用专为纯化human IgG而开发的新型Igselect填料,可以特异的识别结合human的IgG,而不结合其它种属来源的IgG。也可以考虑先用传统的Protein A或G纯化,再使用疏 水层析HIC来去除牛IgG。使用IgG含量较低的血清,也有助于后期的分离纯化。
8,我需要纯化抗体的Fab片段,有什么办法吗?

KappaSelect 是专为纯化 Fab(kappa)片断而设计 的亲和 介质,能有效地捕获 Fab,获得高纯度和高产量的 Fab。 KappaSelect 是通用电气医疗集团客户定制设计填 料项目之一,其以高度刚性的琼脂糖基质为基础,能在大 规模生产中承受高流速和低反压。它是一种亲和填料,配 体能与 Kappa 轻链的恒定区结合(也就是说,缺乏 Kappa 轻链恒定区的片断不会与之结合)。因此,KappaSelect 能够结合其它包含 Kappa 轻链恒定区的目标分子,如 IgA 和 IgM。配体通过长的亲水空间臂与基质相连,使之易于 结合目标分子(图2)。另外Protein G在某些情况下可以和 Fab有结合作用,因此可以用于Fab, F(ab')2的纯化。