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抗体检测蛋白:Western实验操作步骤

普罗安蒂诊断抗体,蛋白表达 2018-08-09

Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。
  1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)
  可以使用适当的裂解液,如Western及IP细胞裂解液、RIPA裂解液等,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒进行抽提。
  2. 电泳(Electrophoresis)
  (1) SDS-PAGE凝胶配制
  SDS-PAGE凝胶可以使用凝胶配制试剂盒进行配制,试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
  (2) 样品处理
  在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
  100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白。
  (3) 上样与电泳
  冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准。
  3. 转膜(Transfer)
  Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
  转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。
  4. 封闭(Blocking)
  转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。
  5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
  参考一抗的说明书,按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。 用微型台式真空泵或滴管等吸尽封闭液,立即加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳,可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
  6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
  参考二抗的说明书,按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 二抗需根据一抗进行选择,例如,一抗是小鼠来源的IgG,则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗,如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H L)。 用微型台式真空泵或滴管等吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
  7. 蛋白检测(Detection of proteins)
  参考相关说明书,使用BeyoECL Plus等ECL类试剂来检测蛋白。压片可以采用专用的压片暗盒进行。
  8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
  如果蛋白样品非常宝贵,可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜。